Projeto Portugal 2020

Código de operação Código que identifica cada projeto efetuado com recurso a fundos europeus.

Data de conclusão

Sumário

A. Identificação do Problema. Contexto e relevância. Os pré-tratamentos tradicionais da biomassa hidrolisam poli e oligossacáridos, mas ao mesmo tempo formam produtos de degradação [8,18-21] que podem ter um impacto inibitório muito significativo nas subsequentes fermentações [16,17,22,23]. Claramente, a compreensão dos efeitos inibitórios e mecanismos de resistência presentes nas mais relevantes fábricas celulares microbianas é extremamente importante, pois pode levar à construção de fábricas celulares mais eficientes (tolerantes) prevenindo a necessidade para a utilização de métodos de destoxificação dispendiosos. B. Objetivos e progresso para além do estado da arte. Neste projeto pretendemos estudar este problema em profundidade, a fim de: i) Compreender totalmente os mecanismos de resistência de E. coli, ii) Projetar e avaliar as potenciais transformações para obter novas fábricas celulares com maior tolerância C. Metodologia Inicialmente (tarefa 1) começamos com um programa de benchmarking bem definido para caracterizar plenamente tolerância diferencial intraespecífica de E. coli aos inibidores metabólicos selecionados usando meios quimicamente definidos. Em seguida, passamos a estudar estirpes selecionadas em condições quimiostato (Tarefa 2) para a obtenção de dados fisiológicos reprodutíveis e massa de células para análise omica (Tarefa 3). Isto será efetuado em fermentadores de bancada utilizando xilose como única fonte de carbono e energia sob a ausência ou presença de inibidores metabólicos selecionados quer individualmente quer em combinações. Serão usadas duas técnicas de cultura contínua diferentes (ver tarefa para detalhes). Tarefa 4 trata da análise de dados de integração e modelagem dos dados fisiológicos e omicos utilizando ferramentas de análise metabólica, ou seja, MFA Metabolic Flux Analysis) e EMA (Elementary Modes Analysis) para produzir novas diretrizes construção de estirpes. Finalmente na tarefa 5, vão ser utilizadas ferramentas de engenharia genética para construir as estirpes que irão ser validadas utilizando hidrolisados lignocelulósicos. Ver cronograma na Memória descritiva Tarefa 1 - Caracterização da diferença de tolerância entre estirpes de E. Coli (18M) Objetivos Caracterização das diferenças de tolerância entre as estirpes de E. coli. Resultados esperados: - Caracterização das diferenças de tolerância entre as diferentes estirpes (1 artigo de revisão por pares) Articulação com outras tarefas: Esta tarefa irá permitir a seleção das linhagens mais relevantes a serem estudadas nas seguintes tarefas, principalmente tarefa 2. O conhecimento adquirido será integrado nos modelos metabólicos na Tarefa 4. Tarefa 2 - Cultura continua na presença de compostos inibitórios (12M) Objetivos -A quantificação dos parâmetros cinéticos e estequiométricos de crescimento de estirpes selecionadas, a tolerância metabólica e a formação do produto sob cultura em quimiostato Resultados esperados: - Caracterização da fisiologia microbiana em quimiostato e condições A-STAT entre as linhagens selecionadas (1 artigo de revisão por pares) Articulação com outras tarefas: Esta tarefa vai permitir a produção de biomassa para ser analisada na tarefa 3 e obter resultados que serão integrados com os da tarefa 1 e nos modelos metabólicos da Tarefa 4. Note que, a duração da tarefa pode exceder o tempo previsto, podem ser necessários ensaios adicionais para afinar o modelo com base na tarefa 4. Tarefa 3. - Estudos ómicos (13M) Objetivos: - Comparar diferenças transcriptomicas, proteômicas e metabolómicas entre os estados metabólicos normais e inibidos Resultados esperados: - Resultados Omicos para E. coli destacando os mecanismos de tolerância (1 artigo de revisão por pares para cada tipo de inibidor selecionado, 3 total) Articulação com outras tarefas: Esta tarefa irá usar a biomassa microbiana produzida na tarefa 2 e vai dar resultados de omica necessários para a construção do modelo na tarefa 4. Tarefa 4 - Modelação metabólica (16M) Objetivos: -Desenvolvimento de um modelo metabólico integrado Resultados esperados: - Modelos metabólicos de E. coli e análise destacando os mecanismos de tolerância (1 artigo de revisão por pares) Articulação com outras tarefas: Esta tarefa será desenvolvida tendo por base os resultados das tarefas anteriores dá as diretrizes para a transformação de E. coli na tarefa 5. Se necessário, serão solicitados resultados suplementares a outras tarefas especialmente à tarefa 2 para ajustar os modelos. Tarefa 5 - Transformação genética e estudos de validação (19M) Objetivos: - Desenvolvimento de uma estirpe de E. coli nova, mais tolerante a inibidores Resultados esperados: - Novas estirpes de E. coli patenteáveis que mostraram maior tolerância aos inibidores (pelo menos uma patente europeia) Articulação com outras tarefas: Esta tarefa será efetuada com os resultados obtidos nas tarefas anteriores, especialmente as diretrizes derivadas de tarefa 4. Gestão de projeto O presente documento de candidatura atuará como o plano de gestão do projeto (cronograma é apresentado em um arquivo anexado). Como a maior parte do trabalho experimental e recursos económicos serão realizado/utilizado no CEBAL, a gestão do projetos é altamente simplificada. De fato, apenas pequenos ensaios (parte da tarefa 2 e 5), serão realizados no LNEG, e o trabalho será apoiado principalmente pelo pessoal do CEBAL e bolseiros. A colaboração com a equipa do LNEG também já está estabelecida por um protocolo assinado entre as duas instituições que têm uma longa tradição de colaboração e conseguido em conjunto vários projetos de sucesso a, um dos quais ganhou o prémio Green Project para R&D em 2013. O PI, em estreita colaboração com os diferentes líderes das tarefas irá lidar com a coordenação e gestão do projeto, aproveitando a infra-estrutura do CEBAL como suporte do projeto. O PI também será responsável pelo funcionamento do projeto, bem como o contato com o Alentejo 2020. O PI e os líderes de tarefas irão reunir-se regularmente e serão responsáveis pela conclusão com êxito de cada tarefa, objetivos e etapas. O PI irá acompanhar quaisquer desvios relacionados com o plano de trabalho e sugerir ações corretivas adequadas. Se necessário, o PI vai denunciar qualquer desvio significativo do plano de projeto para Alentejo 2020. Todos os membros da equipa vai ser obrigado a trabalhar em estreito contato com o seu líder de tarefa e será responsável pela execução do plano de trabalho pessoal acordado. O PI vai promover reuniões regulares, a cada 3 meses, com todos os membros da equipa, para apresentar, discutir e antecipar a estratégia de publicação/difusão do trabalho e resultados. Cada membro da equipe irá produzir relatórios periódicos (a cada 6 meses, acompanhando a conclusão das tarefas) que serão recolhidos pelo PI para produzir os relatórios anuais a serem entregues ao Alentejo 2020