Projeto Portugal 2020

Código de operação Código que identifica cada projeto efetuado com recurso a fundos europeus.

Data de conclusão

Sumário

O plano geral de trabalhos da operação proposta está dividido em 6 tarefas interdependentes, visando a produção de plantas micorrizadas (Cistus - Terfezia). Na sétima tarefa, está previsto um ensaio experimental para avaliar a persistência das micorrizas e a fitness das plantas de Cistus, após a sua instalação nas parcelas de ensaio. Tarefa 1: Amostragem de espécimes de Terfezia arenaria. A amostragem de espécimes de T. arenaria irá contribuir para o conhecimento da sua variabilidade genética e permitirá selecionar o inóculo a utilizar nas tarefas subsequentes. Serão colhidos espécimes frescos de T. arenaria, entre Janeiro a Abril, em locais de produção natural na região Alentejo. No laboratório, os espécimes serão caracterizados morfologicamente com base em seus caracteres macro e microscópicos. Parte dos espécimes determinados serão desidratados numa câmara de ventilação forçada e posteriormente incluídos numa coleção de referência, o Herbário da Universidade de Évora (UEVH- FUNGI). A restante parte será ultracongelada e armazenada para posterior utilização como fonte de inóculo e para a sua caracterização molecular. Paralelamente a esta tarefa, serão colhidas amostras de solo dos locais de produção natural de T. arenaria para posterior caracterização das propriedades físicas e químicas do solo. Tarefa 2: Caracterização molecular dos espécimes de Terfezia arenaria. A determinação específica dos espécimes de Terfezia arenaria baseada unicamente nas suas características morfológicas é muitas vezes insuficiente ou inconclusiva, devido à existência de complexos de espécies crípticas dentro do género Terfezia. Desta forma, a caracterização molecular dos espécimes será essencial para uma determinação decisiva. A extração de DNA, dos espécimes de Terfezia arenaria previamente armazenados, será realizada com o E.Z.N.A. fungal DNA kit (Omega Bio-Tek, Doraville, GA, USA). A região ITS do rDNA será amplificada utilizando os primers ITS5 e ITS4 (Bordallo et al. 2013). Os produtos de PCR serão purificados usando o E.Z.N.A. Cycle-Pure kit (Omega Bio-Tek, Doraville, GA, USA) e posteriormente sequenciados em ambas as direções. Tarefa 3: Isolamento e manutenção de culturas puras de T. arenaria. Nesta tarefa, o micélio de Terfezia, isolado a partir dos espécimes determinados, será mantido em cultura pura e repicado com a frequência necessária para assegurar uma fonte de inóculo regular. Espécimes de T. arenaria serão limpos para retirar as partículas de solo e desinfetados com etanol (70%). Numa câmara de fluxo laminar serão cuidadosamente abertos e porções internas da gleba serão transferidas para caixas de Petri contendo meio de cultura e colocados a incubar numa câmara a 26 ºC. Serão ensaiadas diversas formulações de meios de cultura para otimizar os processos de isolamento e manutenção em cultura pura. Todos os isolados de T. arenaria, serão repicados pelo menos de 3 em 3 semanas. Tarefa 4: Micropropagação de Cistus spp. As plântulas de Cistus spp. são normalmente propagadas por semente, originando cada uma um individuo geneticamente distinto. A tecnologia de micropropagação a partir de meristemas axilares permite a produção em massa de plantas geneticamente idênticas. Nesta tarefa será usada uma estratégia inovadora para a obtenção de plântulas de Cistus spp., micropropagando-as a partir de gemas axilares de plantas adultas pré-selecionadas. Sementes maduras de Cistus spp., colhidas nos mesmos locais de colheita dos espécimes de Terfezia arenaria, serão germinadas assepticamente, de acordo com o procedimento proposto por Talavera et al. (1993). As plântulas resultantes da germinação das sementes serão transferidas para meio de cultura MS (Murashige e Skoog, 1962) e incubadas numa câmara de crescimento de plantas. Quando apresentarem as dimensões indicadas serão inoculadas com T. arenaria e após a síntese micorrízica transferidas para vasos com substrato asséptico e colocadas em estufas. Após 3 meses, as plantas que apresentarem taxas de micorrização mais elevadas serão usadas para fins de micropropagação. Os caules das plantas de Cistus selecionadas serão fragmentados em explantes nodais e a sua multiplicação será efetuada com base no protocolo usado por Madesis et al. (2011). Diferentes combinações e concentrações de reguladores de crescimento serão testados, a fim de otimizar as fases de proliferação, alongamento e enraizamento das plântulas. Tarefa 5: Síntese micorrízica. Com base nas fontes de inóculo obtidas e nas plantas micropropagadas serão efetuados ensaios para conseguir o melhor binómio planta-fungo. Plântulas de Cistus micropropagadas serão transferidas individualmente para tubos de ensaio contendo meio de cultura MS modificado e seguidamente inoculadas com micélio de T. arenaria proveniente das culturas puras obtidas. Diversas formulações serão testadas de forma a otimizar a síntese micorrízica e a permitir um crescimento adequado quer da planta, quer do fungo. Os tubos de ensaio serão incubados numa câmara de crescimento durante 2 meses. Após este período, as plantas inoculadas serão transferidas para recipientes contendo uma mistura de materiais inertes, minerais e orgânicos e aclimatadas em estufa. Tarefa 6: Certificação das plantas micorrizadas. A avaliação da persistência das micorrizas durante e depois da fase de aclimatação é essencial para garantir a qualidade das plantas micorrizadas, antes de se proceder aos ensaios experimentais de campo. Os principais objetivos desta tarefa são a quantificação de micorrizas de T. arenaria por planta micorrizada, descrição das micorrizas formadas e a avaliação da fitness das plantas. A cada 4 semanas, durante a fase de aclimatação, várias plantas de Cistus micorrizadas serão retiradas aleatoriamente para análise da sua fitness (peso seco aéreo, peso seco subterrâneo e teor de macro e micronutrientes) e do seu sistema radicular (observação da abundância e condição das micorrizas de T. arenaria). As extremidades das raízes amostradas serão lavadas em água corrente e coradas. Após a coloração, uma avaliação quantitativa do número de micorrizas formadas será feita por exame microscópico de acordo com as metodologias descritas por Giovannetti e Mosse (1980). Para a completa descrição das micorrizas formadas será necessário observar a sua estrutura interna, pelo que serão selecionadas micorrizas para serem seccionadas num criomicrómetro (Cryosect (Seward Limited, Worthing)). Tarefa 7: Instalação de parcelas experimentais. Após a fase de aclimatação, as plantas micorrizadas serão instaladas em parcelas experimentais e monitorizadas nos anos subsequentes, para avaliar, quer a fitness das plantas, quer a persistência das micorrizas, seguindo os métodos expostos na tarefa 6. Prevê-se que após 3 anos decorridos da instalação das plantas ocorra a produção de túberas, pelo que estes ensaios continuarão a ser monitorizados após o término da operação.