Project Portugal 2020

Operation code Code that identifies each project carried out using European funding.

Conclusion date

Summary

A filosofia subjacente ao projecto baseia-se na maximização de recursos fenotípicos já disponíveis, como é o caso dos registos para crescimento e produtividade por porca, que são sistematicamente recolhidos pelas associações de criadores em explorações de Porco Alentejano distribuídas pelo solar da raça. Para cada fenótipo serão amostrados 100 animais em 12 explorações distribuídas pelo Alentejo, para capturar a variabilidade que existe a nível genético e ambiental dentro e entre explorações. No total serão incluídos 2,400 animais (1,200 por fenótipo), número suficiente para identificar marcadores moleculares, considerando ainda os efeitos ambientais e outros com influência nestes fenótipos. Para crescimento serão selecionados animais que terminarão a fase de Montanheira na primavera de 2016, e para os quais existem registos de pesagens ao desmame, 90 dias, pré-montanheira e pré-abate, o que permitirá analisar toda a curva de crescimento do animal. Para produtividade por porca, que será definida como o número de leitões desmamados por porca por ano, será dada prioridade a fêmeas com registos de parições em vários anos (mínimo de 3 anos). Amostras biológicas serão recolhidas em todos os 2,400 animais, para extração de DNA. Até ao momento, registos relacionados com composição da carcaça e qualidade da carne não são recolhidos no Porco Alentejano, apesar da importância que ambos têm. Neste projeto iremos determinar a primeira caracterização abrangente destes fenótipos, trabalhando diretamente com a Barrancarnes, o maior produtor nacional de presuntos de Porco Alentejano, através do matadouro localizado em Reguengos de Monsaraz. No total serão incluídos 500 animais. O peso de cada carcaça será registado, para determinação do rendimento em carcaça. Posteriormente, para cada carcaça será determinado o peso individual de cada uma das peças nobres da carcaça (presuntos, paletas e lombos) e a espessura da gordura subcutânea. De cada carcaça serão também recolhidas amostras de tecido muscular e adiposo, para determinação de vários parâmetros físicos e químicos de qualidade da carne (cor, pH, retenção de água, textura, força de corte, perfil de ácidos gordos, lípidos totais, proteína total e conteúdo em mioglobina) e extração de DNA. Esta tarefa produzirá o terceiro conjunto de animais com fenótipos disponíveis, e que serão incluídos nos estudos visando a identificação de marcadores moleculares. Adicionalmente, um resultado imediato será a caracterização dos fenótipos relacionados com composição da carcaça e qualidade da carne em Porco Alentejano, cuja importância excede mesmo o âmbito deste projeto. Os 2,900 animais amostrados serão sequenciados utilizando a tecnologia de genotipagem por sequenciação (GBS - genotyping by sequencing), usando o sistema HiSeq 4000 da plataforma de sequenciação Illumina. Serão constituídas pools de 96 animais cada, para um total de 30-31 pools. Cada pool será sequenciada numa pista do sequenciador Illumina, utilizando identificação individual para cada uma das amostras na pool, e um comprimento de sequência de 100 pares de bases. Esta abordagem irá permitir identificar milhares de SNPs para os animais incluídos no estudo, localizados e distribuídos ao longo de todos os cromossomas do genoma do porco, o que permitirá conduzir estudos de associação genómica (GWAS - genome-wide association studies). As análises bioinformáticas dos dados de sequenciação irão inicialmente remover as sequências com baixa qualidade, de forma a só serem utilizados dados de elevada qualidade. As sequências serão mapeadas contra a sequência do genoma do porco, processo que resultará num conjunto inicial de dados que irá conter um número elevado de variantes genéticas. Este volume inicial será posteriormente analisado, para remover as variantes de menor qualidade e manter apenas os SNPs com maior qualidade, nomeadamente aqueles com genótipos válidos para a maioria dos animais incluídos, para posterior utilização nos estudos GWAS. Para todos os fenótipos disponíveis serão determinadas as médias e desvios padrões, e para os casos onde não seja encontrada uma distribuição normal serão efetuadas as transformações necessárias. Para cada fenótipo o modelo estatístico a utilizar será inicialmente testado, de forma a identificar quais os efeitos ambientais que deverão ser incluídos no modelo de análise. O modelo estatístico selecionado será utilizado para conduzir todas as análises de associação, utilizando os fenótipos e SNPs recolhidos anteriormente. Para as combinações SNP-fenótipo onde sejam identificados efeitos significativos será determinada a diferença entre os genótipos do SNP. Correção para testagem múltipla será efetuada com o pacote q-value e associações significativas serão declaradas quando o q-value para cada marcador seja inferior a 0.05. A lista de SNPs significativamente associados com os fenótipos disponíveis será posteriormente analisado, de forma a ordenar hierarquicamente os SNPs, utilizando como critérios informação derivada da análise estatística (q-value) e do SNP (codificante, não-codificante). O conceito principal para o desenvolvimento do sistema de traçabilidade molecular para o Porco Alentejano é a identificação de polimorfismos ao nível do DNA específicos para uma das raças incluídas. Nestas situações, um dos alelos é encontrado apenas numa das raças, não sendo detetado em qualquer uma das outras. Hoje em dia os custos mais reduzidos da sequenciação de última geração permitem que este tipo de SNPs seja encontrado de forma simples. Neste projeto serão incluídas as raças Portuguesas de suínos (Alentejano, Bísaro e Malhado de Alcobaça), a raça Ibérica (Espanha), as quatro mais utilizadas em produção intensiva (Duroc, Pietrain, Landrace e Large White) e ainda ao javali, o ancestral de todas as raças de suínos. Para cada uma destas raças serão incluídos 96 animais, que constituirão o painel de referência para cada raça, e que servirá de futuro como a base contra a qual todos os testes de atribuição de amostras serão efetuados. Serão ainda recolhidas, em cada raça, 50 animais adicionais, que serão tratados como tendo origem desconhecida, de forma a testar a performance do método de traçabilidade. Este projeto produzirá um volume substancial de dados, que incluirá registos fenotípicos, dados de sequenciação, SNPs, análises estatísticas de vários estudos GWAS e resultados do sistema de traçabilidade molecular. É imprescindível que estes dados sejam devidamente organizados, armazenados e acessíveis aos utilizadores da informação recolhida. Uma base de dados será desenvolvida no CEBAL, utilizando a experiência e o equipamento disponíveis nesta instituição. O CEBAL garantirá ainda a manutenção e atualização da base de dados após a conclusão do projeto, garantindo a sua disponibilização para a comunidade científica e ligada à fileira produtiva.