Project Portugal 2030

Summary

A epilepsia afeta aproximadamente 1% da população mundial. Apesar dos avanços nas terapias disponíveis, cerca de 30% dos pacientes continuam refratários à medicação (Loscher et al., 2020). É, portanto, urgente desenvolver formas inovadoras de tratar a epilepsia. A ativação da corrente M é uma das estratégias terapêuticas mais recentes para a epilepsia, mas os medicamentos existentes que dependem de ativadores de canais têm demonstrado efeitos secundários graves (Sills & Rogawski, 2020). Por isso, é imprescindível compreender melhor como os canais M são regulados, para conceber abordagens seletivas para a sua ativação. Identificámos a stargazin como um interator da subunidade do canal M Kv7.2 (Fig. 1). A stargazin, mas não a sua variante genética associada a DI (Caldeira et al., 2022), potencia as correntes Kv7.2 (Figs. 2 e 3). Além disso, animais KI para a variante DI da stargazin apresentam correntes M reduzidas no hipocampo e maior suscetibilidade a crises convulsivas (Fig. 3). Propomos agora encontrar moduladores do complexo Kv7.2/stargazin e testaremos a sua capacidade de modular a excitabilidade neuronal e a atividade de redes em neurónios derivados de células humanas, bem como os seus efeitos anticonvulsivos num modelo murino de epilepsia. Os objetivos deste projeto são: 1. Identificação in silico de moduladores do complexo Kv7.2/stargazin. (i) Com base num modelo computacional para o complexo Kv7.2/stargazin (Fig. 5), por nós construído, serão realizados rastreios in silico de bibliotecas de compostos, com vista a encontrar moléculas que liguem ao complexo e o estabilizem. Um rastreio inicial da Prestwick Chemical Library (de moléculas aprovadas pela FDA) já identificou 25 compostos que potencialmente ligam à interface Kv7.2/stargazin; outras bibliotecas (e.g. selleckchem, medchemexpress, targetmol libraries, ideais para reposicionamento de fármacos, mas também bibliotecas maiores como ZINC15 e ChemSpider) serão também usadas neste rastreio. (ii) Para expandir as possibilidades para além dos compostos existentes, será utilizada uma abordagem de inteligência artificial (IA) generativa para os “hotspots” no complexo Kv7.2/stargazin, treinada em conjuntos de dados moleculares diversificados. A IA irá gerar estruturas moleculares especificamente desenhadas para se ligarem e estabilizarem a interface Kv7.2/stargazin. 2. Validação experimental de compostos moduladores do complexo Kv7.2/stargazin Para testar experimentalmente a capacidade de compostos selecionados (identificados no rastreio in silico ou através de IA generativa) em modular a regulação das correntes mediadas por Kv7.2 pela stargazin, utilizaremos um ensaio in vitro que recorre à tecnologia FluoxOR. Este ensaio permitirá validar um conjunto de compostos moduladores da atividade de Kv7.2. 3. Teste de compostos moduladores de Kv7.2/stargazin em neurónios humanos Registos de eletrofisiologia (patch-clamp) em neurónios humanos, diferenciados a partir de células pluripotentes induzidas, determinarão se os compostos selecionados afetam as propriedades intrínsecas da membrana e as correntes M humanas, assim como a atividade da rede neuronal, em condições basais e num modelo in vitro de crises epilépticas. 4. Teste de compostos moduladores de Kv7.2/stargazin num modelo animal de epilepsia Os compostos mais promissores serão testados num modelo murino de epilepsia induzido quimicamente.